Тимидилат Синтаза: Мутагенез, Функция и Структура.
Из доклада Юрия Проценко на химической конференции 21.01.2004
Введение.
Мой рассказ о Тимидилат синтазе (TS). Это – бисубстратный фермент, в котором кофактор, CH2H4-фолат, служит и как моноуглеродный донор для субстрата dUMP, так и, впоследствии, как восстановитель.
Возможно, немного ферментов подвергнуться более детальному изучению, чем тимидилатсинтаза. В процессе её изучения рассматривалась связь каталитической функции с динамикой и ориентацией с использованием метагенеза, кинетики и определения структуры.Тимидилат синтаза – существенный фермент для синтеза de novo dTMP, нуклеотида, необходимого для синтеза ДНК, и, поэтому, она – важная цель для лекарств. Моноуглеродный фрагмент и гидрид перемещаются из различных мест на кофакторе, и большие вклады в каталитическую силу TS достигаются через динамическую настройку и перестройку реагентов на этих химических стадиях.
На плакате 1 показаны переходные состояния связывания кофактора (mTHF) и метилирования субстрата (dUMP). Конечный продукт реакции dTMP – дезокситимидин монофосфат. Буквами А и В обозначенны, соответчтвенно, Glu – 60 и Tyr – 146.
На плакате 2 жирным показаны кофактор (слева) и субстрат (справа). Правильное выстраивание регентов необходимо, но недостаточно для химического катализа в TS. Пперенос протона между общей кислотой и dUMP помогает переносу метилена к основанию dUMP (стадия 1, Схема 1), а общее основание на ферменте, необходимо для отщепления протона от ковалентного промежуточного соединения фермент-субстрат-кофактор (стадия 2, Схема 1). Общая кислота превращает кофактор в реакционноспособный иминиевый ион при протонировании. Главная проблема в понимании функции консервативных аминокислот в TS – идентифицировать дополнительные роли для подгруппы этих остатков в кислотно-основном катализе или стабилизации предполагаемых переходных состояний в реакции за счет электростатических взаимодействий или водородных связей.
TS взаимодействует с лигандами упорядоченным способом, причем dUMP связывается перед СН2Н4-фолатом. Бинарный комплекс TS c dUMP легко кристаллизуется для большинства мутантов. Связывание кофактора, фактически, включает несколько стадий, включая первоначальную ассоциацию с бинарным комплексом, закрытие активного центра, раскрытие имидазолидинового кольца кофактора и образование ковалентной связи между образующимся иминиевым ионом и С5-атомом dUMP.
Нуклеофильная атака Cys на С6 dUMP происходит одновременно с тесным связыванием кофактора. После присоединения с образованием ковалентного интермедиата II, фермент через Tyr -146 отщепляет протон от С5 dUMP. Скорость этой стадии реакции (k2, Схема 1) может быть измерена с использованием [2-14C,5-3H]dUMP в качестве субстрата и отражается уменьшением отношения 3Н к 14С, поэтому высвобождение трития – хороший анализ на k2.
?-Элиминирование кофактора из интермедиата III было зафиксировано как отдельная стадия в реакции с использованием мутантов по Glu. Для этих мутантов, ковалентный тройной промежуточный комплекс накапливается в гелях, показывая, что скорость определяющая стадия ?-отщепление кофактора, а не отрыв протона из интермедиата II, а ковалентным комплексом, который накапливался в геле, был предположительно интермедиатом III на Схеме 1.
Перенос гидрида от кофактора на экзоциклическую метиленовую группу при С5 пиримидина в интермедиате IV (Схема 1) может быть проанализирован наблюдением образования мутанта. Распределение интермедиата IV между dТMP и его мутантом как функция концентрации кофактора использовалось для расчета констант скоростей для перехода из интермедиата IV в dTMP (k4, Схема 1). Эти константы скорости являются средством количественного вычисления эффективности гидридного переноса в мутантах.
Пять «Наиболее Существенных» для Катализа Остатков
Насыщающий мутагенез почти всех из 25 консервативных остатков, показал удивительный результат: большинство остатков было несущественно для активности, то есть, замещение одной или более другой аминокислотой, позволяло реакции протекать. Сохранение аминокислот между видами отражает консервативные роли, которые могут, и так действительно найдено в TS, распределяться между следующими общими ролями:
Хотя любая из этих ролей может потребоваться для катализа, несколько остатков может потребоваться для каждой, и часто любой одиночный остаток мог быть замещен другими аминокислотами. В ходе исследований оказалось, что пять остатков являются критически важными на разных стадиях реакции. Эти остатки критически необходимы для связывания dUMP (Arg-218), связывания кофактора (Asp-221), присоединению к атому С6 dUMP (Cys-198), отщепления протона от интермедиата II (Tyr-146) и удаления кофактора из ковалентного тройного комплекса (Glu-60).
Arg-218 – это один из пяти аргининов, которые связываются с фосфатной частью dUMP. Водородные связи важны для поддержания структуры активного центра. Arg-218 примыкает к активному центру цистеина и активирует его с помощью электростатических взаимодействий. Эта роль в катализе никогда не была доказана. Asp-221 является единственным остатком, чей водород боковой цепи непосредственно связан с птериновым кольцом кофактора. Кристаллография показала, что водородная связь критична для исключения непродуктивных типов связывания кофактора в тройном комплексе. Например, если акцептор водородной связи, Asp, замещен донором, Asn, птериновое кольцо кофактора связывается в заслоненной конформации и не может конденсироваться с dUMP. ?S Cys-198 нуклеофильно атакует C6 dUMP катализирует конденсацию метиленовой группы кофактора с положением С5 урацильного кольца (Схема 1).
Tyr-146 и Glu-60 являются двумя другими остатками в TS, помимо Cys-198, которые требуются для химических стадий в реакции. Мутации этих остатков привели к сильно пониженным kcat и накоплению реакционного интермедиата – третичного комплекса, что указывает на стадию, для которой необходим этот остаток. Tyr-146, по-видимому, существенен для отщепления протона от С5 dUMP в интермедиате II, либо сам по себе, либо действуя через воду. Glu-60 связан водородной связью через воду с О4 dUMP и, следовательно, может действовать как кислота, также он существенен для ?-элиминирования Н4-фолата из ковалентного интермедиата III (Схема 1).
Субстратсвязывающие Остатки и Их Вклад в Катализ в TS Любая мутация может потенциально ослаблять конкретную стадию реакции, изменяя ориентацию субстрата или кофактора. Электростатические взаимодействия фрагмента dUMP фосфата с консервативным четырехаргининовым связывающим местом TS дает многое для связывания субстрата. Каждый аргинин подает две водородные связи на фосфатные кислороды. В дополнение к этим водородным связям, консервативные остатки серина связаны водородными связями с одним из фосфатных кислородов.
Зарядовый Баланс и Кооперативность при Связывании Фосфата
Водородная связь dUMP к одному из аргининов фиксирует фосфатный фрагмент в оптимальной ориентации для принятия водородных связей от других.Взаимодействие между белком и пиримидиновым кольцом dUMP является первичным фактором ориентации dUMP в TS. Связывание Кофактора Запускает Конформационное Изменение Белка, которое Создает Его Окончательный Связывающий Центр. Связывание кофактора запускает сдвиг некоторых сегментов белка к активному центру, который окружает реагенты, и конфискует их из объема растворителя. Остатки стремятся увеличить гидрофобные контакты с кофактором. Таким образом, места связывания кофактора в ковалентном комплексе полностью образуются только после обширного конформационного изменения.
Величина kcat уменьшается, по крайней мере, в 10 раз, когда мутируют кофактор-связывающие остатки. Преимущество белка дикого типа, состоит в том, что он сильно способствует упорядоченной структуре в структуре тесного тройного комплекса, в которой реагенты хорошо расположены для необходимой реакции.
Gln-217: Главный Активный Центр для Связывания Кофактора. Gln-217 является высококонсервативным остатком в контакте пиримидинового цикла dUMP, благодаря его ключевой структурной роли в подаче водородных связей к О?1 Asn-229 и к карбонилу главной цепи Ser-219. Ser-219 лежит в петле, которая действует как шарнир в ходе конформационного изменения между открытым и закрытым ферментом. Таким образом, Gln-217 имеет две важные роли: он ориентирует карбоксамид главного приимидин-связывающего остатка Asn-229, и он стабилизирует структуру полости активного центра.
Конформационное Изменение Закрывает Glu-60-H2O-dUMP Цикл, Используемый в Катализе. Когда TS претерпевает индуцируемое кофактором конформационное изменение, образуется опосредованная водой водородная связь между О4 dUMP и О?1 Glu-60 (Рисунок 1). Вода, как полагают, функционирует как общая кислота в нескольких стадиях ферментативной реакции, включая присоединение dUMP к каталитическому цистеину, как показано на Схеме 1. His-199 и Asn-229 могут модулировать ориентацию и рКа упорядоченной воды, тем самым тонко перестраивая ее функцию как общей кислоты в ходе нуклеофильной атаки каталитического цистеина на С6 dUMP. Участие этих остатков в сети водородных связей также может усиливать скорость образования тройного комплекса путем стабилизации закрытой формы фермента и фиксации пиримидинового кольца dUMP в оптимальной ориентации для выравнивания кофактора. При проврке просранственного расположения остатковTS относительно dUMP выяснилось, что лишь 0,5 А неправильное их расположение привело к 4 -х – кратному падению константы катализа.
TS содержит много высококонсервативных остатков, чьи функции исследовали с помощью сайт-направленного мутагенеза, кинетики, анализа химических стадий и структуры. Эти исследования идентифицировали три кислотно-осоновных или ковалентных катализатора для различных стадий в реакции:
Вывод
Механизм тимидилат синтазы подчеркивает силу комбинированных мутагенеза, кинетики, частичных реакций, а также множественных структур ключевых интермедиатов в определении факторов, впряженных в ферментный катализ. Несколько общих выводов получено из этого подхода.Во-первых, 0,5 A изменения от средней ориентации реагентов могут вызвать 4-кратное уменьшение скорости катализа. Второе, эффекты остатков на катализ могут включать прямые и непрямые эффекты в стабилизации различных промежуточных состояний реакции. В-третьих, мутация может привести к большому уменьшению скорости по одной из многих различных причин, включая эффекты дальнего действия на структуру и электростатику. Таким образом, результаты многих экспериментов объединяются для определения роли остатков и дают надежное понимание природы ферментного катализа.
В общем, фермент использует тонкие вклады в катализ для достижения скоростей реакции значительно больших, чем скорости, которые могут быть достигнуты для той же самой реакции в пробирке, in vitro, или даже искусственно подбором усилий, приложенных к разработке белков, которые катализируют те же самые процессы.
Проценко Юрий
